對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋，如果加樣不準就會造成誤差，尤其當稀釋倍數大時，很小的誤差，會導致較大的相對誤差，使陰性（或弱陽性）標本呈陽性（或陰性）。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統處理標本，可較好地避免以上誤差。
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關健一步，ELISA試劑盒應引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作，得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關，ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。
每種試劑都有其*反應模式，其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應時間長，會造成整板本底高，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴，ELISA試劑盒反應板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發，板上應加蓋。
作為記錄測定結果的儀器，酶標儀的性能穩定與否，決定結果的可靠度。首先酶標儀應定期進行保養，對濾光片要定期校正；其次酶標儀波長設置要正確，使用雙波長，一個檢測波長，一個參比波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標儀讀數時先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書
綜上所述，盡管目前上以及我國有了部分標準血清或參比血清（血清盤），但是酶聯免疫吸附技術目前在技術上尚未做到標準化。受方法學及技術條件的限制，在酶聯免疫吸附測定中有時不可避免的會出現一定的非特異性，ELISA試劑盒我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底，從而提高檢測的特異性，并得到更準確、可靠的實驗結果。
酶聯免疫吸附試驗（ELISA）自問世以來，以其敏感性高，特異性強，操作簡便、安全，開創了免疫學診斷的新紀元在臨床診斷方面得到了廣泛的應用。但是ELISA試劑盒在它的研究、生產及使用中常常會碰到非特異性顯色問題，ELISA試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物，操作不當等因素都會導致這樣的結果。本文就在實驗過程中產生的一些原因及如何采取一些措施，消除非特異性顯色作以分析。
風濕因子（RF）、黃疸等，類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體，多數為IgM類，能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應，從而呈現非特異性顯色。
黃疸血標本中常含有內源性過氧化物酶，如用辣根過氧化物酶為標記物，就有可能產生非特異性顯色。
常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血，被細菌污染，標本凝集不全等。溶血標本，紅細胞溶解破裂，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP（辣根過氧化酶），ELISA試劑盒有國內報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性。如在冰箱中保存過久，其中的IgG可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。因此，血標本在采集處理時應小心，在冰箱中保存不易過久。
標本凝集不全時，血清中會殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽性。
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