呋喃妥因代謝物檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)（酶聯(lián)免疫法）
 
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)蜂蜜、魚(yú)、蝦、禽、肝臟等中的呋喃妥因代謝物（AHD），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的呋喃妥因代謝物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗呋喃妥因代謝物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含呋喃妥因代謝物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中呋喃妥因代謝物的殘留量。
2 呋喃妥因代謝物檢測(cè)試劑盒技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，45min～15min
2.3 檢測(cè)下限：
組織、肝臟…………………………0.1ppb
蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.1ppb
奶粉、蛋粉…………………………0.1ppb
魚(yú)/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾，定量下限為0.15ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
呋喃妥因代謝物…………………100%
呋喃唑酮代謝物…………………<0.1%
呋喃西林代謝物…………………<0.1%
呋喃他酮代謝物…………………<0.1% 
2.5 樣本回收率：
組織、肝臟…………………………85±25%
蜂蜜、牛奶、腸衣…………………80±20%
奶粉、蛋粉…………………………85±25%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb…………1ml
衍生化試劑（黑蓋）………………10ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說(shuō)明書(shū)………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、氫氧化鈉、濃HCl、K2HPO4·3H2O、亞硝基鐵化鉀（K2Fe(CN)5(NO)?2H2O）、ZnSO4·7H2O
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：0.36M亞硝基鐵化鉀溶液（牛奶、奶粉樣本）
11.9g亞硝基鐵化鉀加去離子水至100ml溶解。
配液2：1.04M硫酸鋅溶液（牛奶、奶粉樣本）
    29.8g硫酸鋅加去離子水至100ml溶解。
配液3：0.1M  K2HPO4 溶液
    稱11.4g K2HPO4?3H2O加去離子水溶解定溶至500ml。
配液4：1M  HCL 
    8.6mL濃HCL加去離子水定容至100mL。
配液5：1M  NaOH溶液
    稱取4g NaOH，加去離子水定容至100ml。
配液6：復(fù)溶液
    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋?zhuān)糜跇颖镜膹?fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 牛奶樣本處理方法
1）取5ml樣本于離心管中，加250ul 亞硝基鐵化鉀溶液（配液1）振蕩混合30秒，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取上清1.1ml，加4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；
3）在37℃過(guò)夜孵育(約16小時(shí))或50℃（超過(guò)50℃時(shí)會(huì)影響分層效果）水浴孵育3小時(shí)；
4）分別加入5ml 0.1M K2HPO4 溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和5ml的乙酸乙酯，振蕩5分鐘；
5）室溫下4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘； 
6）取出2.5ml的上層液到另一個(gè)離心管中，50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?br />7）用1ml正已烷溶解殘留物，加入1ml復(fù)溶工作液充分振蕩混合30秒；室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘；
8）去除上層正已烷，取50μl下層液用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)為2    檢測(cè)下限：0.1ppb
5.3.2 奶粉、蛋粉樣本處理方法
1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于離心管中，加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；
2）在37℃過(guò)夜孵育(約16小時(shí))或50℃（超過(guò)50℃時(shí)會(huì)影響分層效果）水浴孵育3小時(shí)；
3）加250ul 亞硝基鐵化鉀溶液（配液1）振蕩混合30秒，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
4）取全部上清到另一個(gè)離心管中，后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，4）”
5.3.3 蜂蜜、組織、腸衣、肝臟、雞蛋樣本處理方法
1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于離心管中，加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；
2）后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，3）”
5.3.4 熟食樣本處理方法
1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于50ml離心管中，加入4.5ml甲醇和0.5ml去離子水，振蕩2min，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，去除全部液體；
2）加入5ml乙和5ml正己烷，振蕩2min，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，去除全部液體；
3）在沉淀中加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；
    注：熟食的添加回收試驗(yàn)請(qǐng)?jiān)诖瞬郊尤敫邩?biāo)準(zhǔn)。
4）后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，3）”
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。
    若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。